на правах рукописи
Мижевикина Анна Сергеевна
ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОБИОТИКА ЗИМУН-14.40 ПРИ СУБКЛИНИЧЕСКОМ МАСТИТЕ У КОРОВ
16.00.04 – ветеринарная фармакология с токсикологией
автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Троицк, 2006
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины»
Научные руководители - доктор ветеринарных наук, профессор Ноздрин Григорий Антонович
Официальные оппоненты -
Ведущая организация –
Защита состоится «___» ___________ 2006 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д. 220.066.01 при Уральской государственной академии ветеринарной медицины (457100, Челябинской обл., г. Троицк, ул. Гагарина, 13, тел. 2-48-88, 2-27-16).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уральской государственной академии ветеринарной медицины.
Автореферат разослан «___»_____________ 2006 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета
1. Общая характеристика работы
Актуальность темы
Молочное скотоводство занимает одно из основных мест в продовольственном комплексе страны. Значение этой отрасли определяется не только высокой долей ее в производстве валовой продукции, но и большим влиянием на экономику сельского хозяйства, на уровне обеспечения населения продуктами питания (А. Данкверт, Л. Зернаева, 2003).
Качество молока зависит от ряда факторов, однако, основным источником загрязнения молока на первичном этапе его получения являются больные маститом коровы.
Известно множество способов лечения мастита у коров, предусматривающих физические методы (низкоинтенсивное лазерное излучение), этиотропные методы (использование химиотерапевтических препаратов), а также патогенетическую терапию (внутриаортальное введение новокаина по Д.Д. Логвинову). Известен способ лечения мастита у коров, который основан на применении антибиотиков, фитонцидов, сульфаниламидных, нитрофурановых и ферментных препаратов отдельно или в различных сочетаниях (И.И. Балковой, В.М. Карташова, 1985; А.В. Бойко, М.Н. Волкова, 2003).
Основной проблемой последних лет является широкое распространение резистентных форм патогенных микроорганизмов и снижение эффективности ряда антибиотиков. Фундаментальные исследования современной биологической и медицинской науки позволили разработать и внедрить в практику новый класс препаратов – пробиотики. Они обладают широкой гаммой позитивных фармакологических эффектов и, кроме того, они значительно экологичнее многих других лекарственных средств (Г.А. Ноздрин, А.Г. Ноздрин, А.И. Леляк, 1998). Важным арсеналом совершенствования пробиотиков являются бактерии группы Bacillus. Значительных успехов в разработке пробиотических препаратов на основе Bac. subtilis достигли сотрудники НПФ «Исследовательский центр». Эти работы ведутся совместно с учеными кафедры фармакологии и общей патологии НГАУ (Г.А. Ноздрин, 2003). Пробиотические препараты широко применяются при различных патологиях организма, но применение пробиотиков при акушерско-гинекологических заболеваниях является малоизученным. Сотрудниками НПФ «Исследовательский цент» создан новый пробиотический препарат Зимун-14.40, который был испытан в качестве лечебного препарата при субклиническом мастите у коров.
Цель и задачи исследований
Цель наших исследований состояла в изучении токсических и фармакологических свойств нового препарата Зимун-14.40, терапевтической эффективности при субклиническом мастите у коров, его влиянии на морфо-биохимические показатели крови, качество молока коров после лечения.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Изучить параметры острой и хронической токсичности пробиотика Зимун-14.40, его эмбриотоксические и тератогенные свойства на лабораторных животных.
2. Определить аллергенные и раздражающие свойства пробиотика при местном воздействии на кожу и слизистые оболочки, выявить антимикробную активность Зимуна-14.40 в отношении возбудителей субклинического мастита у коров.
3. Установить наиболее оптимальный способ введения и дозы пробиотика при лечении субклинического мастита у коров.
4. Определить влияние пробиотика Зимун-14.40 на некоторые морфо-биохимические показатели крови, а также показатели клеточного и гуморального иммунитета на фоне терапии мастита у коров.
5. Установить изменения показателей качества и пищевой ценности молока после применения пробиотика Зимун-14.40.
9. Дать экономическую оценку эффективности применения пробиотика Зимун-14.40 для лечения субклинического мастита у коров.
Научная новизна
Изучен ряд токсических и фармакологических характеристик нового препарата Зимун-14.40, определены оптимальная доза, способ его введения и доказана его терапевтическая эффективность при субклиническом мастите у коров. Установлено его положительное влияние на морфологические, биохимические, иммунологические показатели крови коров, физико-химические и санитарно-гигиенические показатели молока и его аминокислотный состав.
Теоретическая и практическая ценность работы
Проведенное комплексное исследование нового пробиотика Зимун-14.40 позволяет рекомендовать его применение для лечения субклинического мастита у коров, сократить сроки терапии и улучшения качества молока после выздоровления. Результаты экспериментальных исследований могут быть использованы в учебном процессе по ветеринарной фармакологии, токсикологии и акушерству. По результатам исследований оформлена заявка на изобретение «Способ лечения субклинического мастита у коров», № 2005137498/13(041890).
Основные положения, выносимые на защиту:
Новый пробиотик Зимун-14.40 относится к группе малоопасных лекарственных веществ, не обладает кумуляцией, тератогенными и эмбриотоксическими свойствами.
Зимун-14.40 обладает выраженной бактерицидной активностью относительно возбудителей субклинического мастита у коров.
Пробиотик Зимун-14.40 обладает высокой терапевтической эффективностью при субклиническом мастите у коров; наиболее оптимальной является доза пробиотика 10 мл один раз в сутки при паравагинальном введении.
Применение пробиотика Зимун-14.40 нормализует белковый и углеводный обмены крови, стимулирует клеточный и гуморальный иммунитет, улучшает физико-химические и санитарно-гигиенические показатели и биологическую ценность молока.
Использование пробиотика Зимун-14.40 для лечения субклинического мастита у коров экономически рентабельно.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Российской научно-практической конференции «Новые пробиотические и иммунотропные препараты в ветеринарии», НГАУ, 2003; на конференции молодых ученых «Молодые ученые в решении проблем АПК», ФГОУ ВПО Тюменская ГСХА, 2003; на VII межрегиональной научно-практической конференции «Перспективные направления научных исследований молодых ученых и специалистов Урала и Сибири», ФГОУ ВПО «УГАВМ», г. Троицк, 2003 г; на международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» ФГОУ ВПО «УГАВМ», г. Троицк, 2004; на Сибирском международном ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины», г. Новосибирск, 2005 г., на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, Ижевск, 2005 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в которых отражены основные результаты экспериментальных исследований.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на _____ страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, предложения, список литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами. Список литературы включает 163 источника, в том числе 33 зарубежных авторов.
2 Собственные исследования
2.1 Материал и методы исследований
Работа выполнена в 2002-2005 годах на базе Уральской государственной академии ветеринарной медицины. Тема работы является разделом научно-исследовательской деятельности кафедры фармакологии и общей патологии Новосибирского государственного аграрного университета, регистрационный номер темы 01.200.1 13903.
Экспериментальная часть работы была проведена на базе хозяйства «Новотроицкое» Троицкого района Челябинской области. Лабораторные исследования проводились в лабораториях кафедры вирусологии и микробиологии, товароведения и экспертизы продовольственных товаров, акушерства, в межкафедральной лаборатории УГАВМ.
Объектом исследований служил пробиотик Зимун 14.40, разработанный учеными НПФ «Исследовательский центр» и сотрудниками кафедры фармакологии и общей патологии НГАУ содержащий споровую биомассу бактерий Bacillus subtilis и наполнитель. Препарат представляет собой прозрачную мутноватую жидкость, при хранении допускается образование осадка желтовато-беловатого цвета на дне флакона, который при встряхивании разбивается на равномерную взвесь. Выпускают в стерильных герметически упакованных флаконах по 10 мл. Срок хранения при температуре 6–10 °С 1 год.
В опытах были использованы 40 дойных коров в возрасте 4-5 лет с живой массой 300-350 кг, 10 кроликов породы шиншилла, с массой тела 3-3,5 кг в возрасте 1-1,5 года, 110 белых мышей массой 20-22 грамма.
Экспериментальная часть работы была проведена в II этапа. На первом этапе были изучены острая и хроническая токсичность препарата Зимун-14.40, его эмбриотоксические, тератогенные, и бактерицидные свойства.
Острую и хроническую токсичность пробиотика Зимун-14.40 изучали на белых мышах массой (20-22) г согласно «Методических указаний по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (Л.П. Маланин и др., 1988). Для определения острой токсичности было сформировано 6 групп животных по 6 голов в каждой. Перед началом эксперимента мышей выдерживали на карантине в течение 14 дней. Испытуемый препарат вводили непосредственно в желудок с помощью шприца с тупой иглой, на конце которой наплавлено олово. Зимун-14.40 был испытан в дозах: (0,8-2) мл на животное. Дальнейшее увеличение дозы было не реальным, т.к. объём желудка у белых мышей составляет (1,5-2) мл. Наблюдение за животными вели в течение 14 дней, отмечая признаки интоксикации и количество погибших животных.
Для изучения хронической токсичности препарата были сформированы 4 группы белых мышей по 10 голов в каждой с живой массой (20-22) грамма. Мыши содержались на обычном рационе вивария. Каждый день на протяжении 2,5 месяцев в питьевую воду мышам добавляли испытуемый препарат: в первой группе в дозе 0,5 мл на голову, второй группе – 0,8 мл; третьей – 1 мл. Четвертая группа служила контролем, им давали питьевую воду без добавок. В ходе эксперимента учитывали следующие показатели: внешний вид и поведение животных, состояние шерстного покрова и видимых слизистых оболочек, подвижность, отношение к корму, гибель.
При изучении отдаленных последствий влияния препарата Зимун-14.40 были использованы 18 белых мышей с живой массой (22-25) г. За мышами наблюдали 30 дней, самцы и самки содержались раздельно. По принципу аналогов были сформированы 3 группы по 6 голов в каждой (4 самки и 2 самца). В первой и второй опытных группах на протяжении 2-х месяцев ежедневно в питьевую воду мышам добавляли испытуемый препарат в дозах по 0,5 мл на животное – в первой группе и по 1 мл – во второй группе соответственно. Третья группа служила контролем и содержалась на обычном рационе вивария. Наблюдение вели в течение 2-х месяцев. Учитывали общее состояние, число самок, давших потомство, число мышат в помёте, их подвижность, время отлипания ушей, появление шерсти, пропорциональность развития тела и хвоста, отклонения в развитии и поведении. За полученным потомством наблюдали в течение месяца.
Исследование аллергенных и раздражающих свойств пробиотика при нанесении на кожу и слизистые оболочки проводили согласно «Методических указаний по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (Л.П. Маланин и др., 1988) на 10 кроликах породы шиншилла. В области спины выстригали участки шерсти. На один участок наносили испытуемый препарат, на другой – дистиллированную воду. Ежедневно измеряли толщину кожной складки, отмечали расчесы, признаки дерматита, выпадение волос, трещины, гиперемию. При исследовании раздражающих свойств на слизистые оболочки 2 капли неразбавленного препарата наносили однократно в конъюнктивальный мешок одного глаза, в другой глаз – такое же количество дистиллированной воды. Наблюдения вели в течение 3-х суток. Отмечали гиперемию, отечность, признаки конъюнктивита, отек век.
Определение бактерицидной активности пробиотика проводили согласно «Методических указаний по ветеринарной микробиологии и иммунологии» (Т.С. Костенко и др., 1989). Материалом исследования служило молоко от коров, больных субклиническим маститом. Молоко исследовали в 8 разведениях, каждое последующее готовилось из предыдущего в пропорции 1:10. Посев проводили из последних трех разведений на следующие питательные среды: солевой агар – для выделения стафилококков; агар Эндо – для выделения кишечной палочки и сальмонелл, агар Сабуро – для выделения микроскопических грибов. Из всех разведений, кроме первого, проводили посев на обычные питательные среды: МПА (мясо-пептонный агар) и МПБ (мясо-пептонный бульон). Все посевы культивировали в термостате при температуре 37 0С в течение 24 часов. Из выросших культур готовили мазки и микроскопировали.
Выделение чистой культуры возбудителя проводили по методу Дригальского (Т.С. Костенко и др., 1989) – метод посева на плотную питательную среду (МПА).
Ферментативную активность выделенных культур изучали на средах Гиса, посев культур осуществляли по общепринятой методике. После инкубирования в термостате учитывали результат ферментации углеводов.
Патогенные свойства возбудителя изучали экспериментальным заражением лабораторных животных. Павших мышей вскрывали, из органов и тканей делали посевы на питательные среды: агар Эндо, солевой агар, МПА, МПБ, кровяной агар. Из выросших колоний готовили мазки и микроскопировали.
Определение чувствительности выделенных возбудителей к пробиотику Зимун 14.40 проводили путем добавления к 2 мл стерильной жидкой питательной среды (МПБ) 2 тыс. микробных тел возбудителя и 2 мл пробиотика. Чистая культура возбудителя в питательной среде и смесь пробиотика с МПБ служили контролем. Все посевы помещали в термостат при температуре 37 0С на 48 часов. После этого из каждой пробирки делали пересев на плотную питательную среду методом «штриха» в чашки Петри (Т.С. Костенко и др., 1989). Через 48 часов инкубирования в термостате учитывали рост возбудителя. Из всех выросших колоний готовили мазки и микроскопировали.
На втором этапе исследований был осуществлен предварительный опыт по установлению оптимального способа введения и дозы пробиотика Зимун-14.40 для лечения коров, больных субклиническим маститом. Данный эксперимент был проведен на базе хозяйства «Новотроицкое» Троицкого района Челябинской области.
В результате диспансеризации всего поголовья коров по состоянию молочной железы субклинический мастит был выявлен у 55 % животных. Молоко от коров исследовали быстрым маститным тестом – пробой с димастином, двухкратно с интервалом 48 часов.
Из выявленных больных коров по принципу аналогов сформировали 5 опытных групп по 3 головы в каждой.
Первой группе коров пробиотик вводили внутривымянно в дозе 5 мл в каждую больную четверть, один раз в сутки ежедневно после вечернего доения; второй группе по той же схеме вводили 8 мл препарата; третьей – 10 мл; четвертой – 12 мл; пятой – 15 мл пробиотика. Ежедневно молоко от опытных коров исследовали с помощью быстрого маститного теста (проба с димастином) на обнаружение скрытого мастита.
Одновременно был испытан другой способ введения пробиотика для лечения субклинического мастита – в паравальнальную клетчатку. Для изучения терапевтического эффекта при паравагинальном введении Зимуна-14.40 из коров, больных субклиническим маститом, по принципу аналогов были сформированы 5 опытных групп по 5 голов в каждой. Пробиотик был испытан в дозах 5 мл, 8 мл, 10 мл, 12 мл, 15 мл. Препарат вводили 1 раз в сутки до выздоровления коров, которое подтверждали быстрым маститным тестом и пробой отстаивания.
На основании первого и второго этапов эксперимента была установлена наиболее оптимальная дозировка и способ введения пробиотика Зимун-14.40 которая затем использовалась в основном опыте.
Производственный эксперимент по терапевтической эффективности применения пробиотика Зимун-14.40 при субклиническом мастите у коров был проведен в хозяйстве «Новотроицкое» Троицкого района Челябинской области.
Из выявленных коров, больных субклиническим маститом, по принципу аналогов были сформированы 2 опытные группы животных по 10 голов в каждой. Коров I группы лечили принятым в хозяйстве методом – ежедневно внутривымянно 2 раза в день после утренней и вечерней дойки вводили мастисан А в дозе 5 мл до полного выздоровления.
Коровам II группы вводили 10 мл пробиотика Зимун-14.40 в паравагинальную клетчатку ежедневно 1 раз в день до полного выздоровления.
Выздоровление определяли по двухкратной отрицательной реакции с димастином.
У всех животных до и после выздоровления брали пробы крови и молока. Кровь исследовали на кафедре клинической диагностики и в отделе биохимического анализа межкафедральной лаборатории УГАВМ.
В цельной крови определяли морфологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов и лейкоцитов, лейкограмму общепринятыми в ветеринарии методами.
В сыворотке крови определяли биохимические показатели: общий белок определяли рефрактометрическим методом (И.П. Кондрахин, 1985), белковые фракции – нефелометрическим экспресс-методом (Б.И. Антонов, 1991), холестерин - по Ильку, при помощи набора «БИО-ЛА-ТЕСТ» (Б.И. Антонов, 1991), глюкозу - глюкозо-оксидантным методом при помощи набора «Глюкоза – ФКД», активность АсАТ и АлАТ - по Райтману и Френкелю с помощью набора «БИО-ЛА-ТЕСТ» (И.П. Кондрахин, 1985), общие липиды - по Целльнеру (В.М. Холод, Г.Ф. Ермолаева, 1988), пировиноградную кислоту -колориметрическим методом (модифицированный метод Умбрайта) (В.М. Холод, Г.Ф. Ермолаева, 1988).
Реакцию определения бактерицидной активности сыворотки крови осуществляли фотонефелометрическим методом по О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой (1966) в модификации Ю.М. Маркова (1968) (С.И. Плященко, В.Т. Сидоров, 1979).
Лизоцимную активность сыворотки крови исследовали по Ю.М. Маркову (1974) ( Е.С. Воронин с соавт., 2002).
Для изучения клеточных факторов естественной резистентности определяли фагоцитарную активность нейтрофилов крови по методу В.С. Гостева ( С.И. Плященко, В.Т. Сидоров, 1979).
В пробах молока коров были исследованы физико-химические и санитарно-гигиенические показатели: жирность, плотность, СОМО, белок, кислотность, бактериальная обсемененность, содержание ингибирующих веществ, аминокислотный состав.
Жирность, плотность, белок и СОМО исследовали на молочном анализаторе «Клевер М-1», кислотность согласно ГОСТ 3624-92, бактериальную обсемененность по ГОСТ 9225–84, ингибирующие вещества по ГОСТ 23454-79, аминокислотный состав – в межкафедральной лаборатории УГАВМ на аминокислотном анализаторе. Контролем служили показатели молока, взятого от здоровых животных.
Статистическую обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами вариационной статистики с использованием IBM PC. Доверительную вероятность (Р) находили с учетом числа имеющихся наблюдений по таблице Стъюдента.
Экономическую эффективность лечебных мероприятий рассчитывали по «Методике определения экономической эффективности ветеринарных препаратов» (Ветеринарное законодательство, 2000).
2.2 Результаты изучения токсических свойств пробиотика Зимун 14.40
Критерием острой токсичности принято считать гибель подопытных животных в течение 14 дней после однократного введения испытуемого препарата в организм. Препарат был испытан в дозах (0,8-2) мл на животное. За этот период гибели подопытных мышей отмечено не было. Аппетит у животных был сохранен, не было отмечено изменений поведенческих реакций, клинических признаков отравления. Шерстный покров был блестящий, гладкий, не был взъерошен.
При ежедневном введении 0,5 мл и 1 мл пробиотика на голову на протяжении 2,5 месяцев не было отмечено изменений внешнего вида мышей, аппетит был сохранен, не изменился характер и степень активности, не наблюдалось клинических признаков, свойственных отравлению, а также гибели подопытных животных.
При длительном введении пробиотика Зимуна-14.40 в организме белых мышей не было выявлено эмбриотоксических и тератогенных свойств. Вместе с тем, данный препарат повышал воспроизводительную функцию мышей, увеличивал число мышат в потомстве на (44,4-55,6) %, стимулировал их рост и развитие.
Пробиотик Зимун-14.40 не оказывал раздражающего действия при накожных аппликациях и конъюнктивальных пробах на кроликах и не вызывал аллергических реакций.
Можно сделать вывод, что Зимун-14.40 в дозах (0,8-2) мл на голову (100 мл на кг массы тела) и при многократном длительном поступлении в дозах (0,5-1) мл на голову ((25-50) мл на кг) позволяет отнести его, согласно ГОСТ 12.1.007-76, к группе малоопасных лекарственных веществ. Кроме того, пробиотик не обладает кумулятивными, раздражающими, аллергенными свойствами.
2.3. Антимикробная активность пробиотика Зимун-14.40 в отношении возбудителей субклинического мастита у коров
В хозяйстве «Новотроицкое» Троицкого района Челябинской области у 10 коров, больных субклиническим маститом, отобранных методом случайной выборки, из больных четвертей вымени были взяты пробы альвеолярного молока. Молоко было подвергнуто микроскопическому, бактериологическому и биологическому исследованию на кафедре микробиологии и вирусологии УГАВМ. Полученные данные позволили установить, что возбудителем субклинического мастита у коров является патогенный стафилококк (St. еpidermidis), сопутствующей микрофлорой были кишечная палочка (E. сoli) и бактерии группы кишечной палочки (БГКП). Вышеперечисленные микроорганизмы были обнаружены в 100 % проб молока, взятых от коров с субклиническим маститом. Идентификация данной микрофлоры была подтверждена ферментативными и патогенными свойствами возбудителей.
При добавлении к культурам возбудителей: St. еpidermidis, E. сoli, БГКП и смеси этих трех культур (2 тыс.микробных тел), добавляли по 2 мл пробиотика Зимун-14.40. Во всех чашках Петри выросли колонии гладкие, блестящие, не прозрачные, серо-белого цвета, легко снимающиеся с поверхности агара. Из всех выросших колоний были сделаны мазки и проведена их микроскопия. В мазках были обнаружены большие грамположительные палочки, спорообразующие палочки.
Результаты проведенных исследований показали, что препарат Зимун-14.40 обладает бактерицидной активностью к возбудителям субклинического мастита (St. еpidermidis, E. сoli, БГКП) что подтверждается абсолютным подавлением роста возбудителей микрофлоры на жидких и плотных питательных средах в опытах in vitro и микроскопическими исследованиями.
2.4 Установление наиболее оптимального способа введения и дозы пробиотика при лечении субклинического мастита у коров
Предварительный опыт был проведен на базе хозяйства «Новотроицкое» Троицкого района Челябинской области на 5 опытных группах коров (по 3 головы в каждой).
Первой группе коров пробиотик вводили внутривымянно в дозе 5 мл в каждую больную четверть один раз в сутки ежедневно после вечернего доения; второй группе по той же схеме вводили 8 мл препарата; третьей группе – 10 мл; четвертой – 12 мл; пятой – 15 мл пробиотика соответственно. Ежедневно молоко опытных коров исследовали с помощью быстрого маститного теста на предмет обнаружения скрытого мастита.
Пробиотик с лечебной целью вводили в вымя (8-9) дней. Дальнейшее введение препарата в вымя мы посчитали нецелесообразным, т.к. в хозяйстве традиционно для лечения субклинического мастита используется мастисан А и выздоровление при этом способе лечения наступает через 7 дней.
Внутрицистернальное введение пробиотика не вызывало выздоровления у коров. Следует также отметить, что терапевтическая эффективность при интрацистернальном введении пробиотика не зависела от вводимых доз препарата. Так, выздоровление у опытных коров не было отмечено как от дозы 5 мл, так и от доз 10 и 15 мл. Одновременно было отмечено, что после применения пробиотика в молоке обнаруживались густые, белые хлопья творожистой консистенции.
При выяснении причины появления хлопьев в сдаиваемом молоке было принято во внимание сообщение В.В. Смирнова и др., 1993 [3] о том, что Bacillus subtilis, основной микробный ингредиент препарата Зимун-14.40, имеет способность закислять среду обитания. Для подтверждения данной гипотезы были проведены опыты in vitro. Было взято 15 пробирок с альвеолярным молоком. В первых 10 пробирках было по 10 мл молока от здоровых животных, а в 5 пробирках столько же молока от коров, больных субклиническим маститом. Первые пять пробирок (со здоровым молоком) оставили для контроля, а в остальные пробирки добавили по 5 мл пробиотика Зимун-14.40. Все пробирки поместили в термостат с температурой 37 ºС. Учет реакции проводили через каждые 2 часа. Результаты эксперимента показали следующее: пробиотик Зимун-14.40 закисляет молоко, что приводит к свертыванию его белковой части. Закисление молока от коров, больных субклиническим маститом происходит более интенсивно и уже через 6 часов наблюдения в молоке были обнаружены творожистые хлопья. В молоке здоровых коров при добавлении пробиотика творожистые хлопья были обнаружены только через 10 часов. Молоко коров, больных субклиническим маститом, закисало в 1,67 раза быстрее, по сравнению с молоком здоровых животных. Это и понятно, так как в молоке здоровых животных присутствует так называемая бактерицидная фаза, предупреждающая развитие патогенной микрофлоры, продолжительность которой в условиях термостатирования 2-3 часа.
На основании вышеизложенного можно сделать вывод о том, что пробиотик Зимун-14.40 нельзя рекомендовать для интрацистернального введения.
Не получив положительного терапевтического эффекта при интрацистернальном введении пробиотика при субклиническом мастите у коров был опробован другой способ введения. Пробиотик вводили в паравагинальную клетчатку. Для этого использовали иглы длиной (7-9) см, точкой вкола являлась середина расстояния между верхним углом вульвы и анусом. Иглу вводили одномоментным толчком, направляя слегка вниз, параллельно прямой кишке на глубину 5 см.
Для установления оптимальной лечебной дозы пробиотика при паравагинальном введении Зимун-14.40 вводили в паравагинальную клетчатку коровам в дозах (5-15) мл ежедневно один раз в сутки. Препарат вводили до выздоровления коров, которое подтверждали быстрым маститным тестом с димастином и пробой отстаивания. Введение пробиотика Зимун-14.40 в паравагинальную клетчатку с целью лечения субклинического мастита у коров оказалось эффективным. Все опытные коровы, больные субклиническим маститом, которым паравагинально вводили Зимун-14.40, выздоровели. Анализируя эффективность используемых доз следует отметить, что более быстрый терапевтический эффект наблюдался от дозы 10 мл. При введении этой дозы выздоровление наступило в среднем через (4,2±0,13) дня.
2.5 Терапевтическая эффективность применения Зимуна-14.40 при скрытых маститах у коров
Терапевтическая эффективность применения пробиотика Зимун-14.40 при лечении коров с субклиническими маститами была изучена на 20 коровах, которых по принципу аналогов поделили на 2 опытные группы по 10 голов в каждой. Первую группу лечили принятым в хозяйстве способом: ежедневно внутривымянно 2 раза в день после утренней и вечерней дойки вводили мастисан А в дозе 5 мл до полного выздоровления. Данная группа служила контролем.
У коров второй группы лечение было следующим: паравагинально вводили пробиотик Зимун-14.40 в дозе 10 мл на животное ежедневно 1 раз в день до выздоровления.
Всех животных лечили до полного выздоровления, которое устанавливали по двухкратной отрицательной реакции проб молока с димастином.
В I группе, которую лечили мастисаном А, из 10 коров выздоровели 6, т.е. 60 %. Срок лечения составил (7,0±0,82) дня. Кроме того, у 4-х коров I группы наблюдали осложнение - скрытый мастит в процессе лечения перешел в клинически выраженный.
Во второй группе, в которой животным вводили паравагинально пробиотик, из 10 коров выздоровели все 10, выздоровление составило 100%. При этом продолжительность лечения составила в среднем 4,2±0,13 суток.
2.6 Изменение морфологических и биохимических показателей крови коров при лечении субклинического мастита пробиотиком
Влияние пробиотика Зимун-14.40 на гематологические показатели изучали во время опыта по выявлению терапевтической эффективности пробиотика при лечении субклинического мастита у коров. Полученные данные сравнивали с показателями крови коров с субклиническим маститом, здоровых и коров, которым с лечебной целью вводили антибиотик мастисан А.
В морфологическом спектре крови коров в ходе лечебных мероприятий были отмечены следующие изменения. После лечения мастисаном А количество эритроцитов и гемоглобина в крови по сравнению с показателями больных коров возросло на 2,61 % и на 1,39 % соответственно. После лечения пробиотиком на 7,33 % возрастает содержание гемоглобина по сравнению с показателями здоровых коров, но эти изменения были в пределах верхней границы физиологической нормы.
Содержание лейкоцитов по сравнению с показателями крови больных животных после лечения мастисаном А на 34,55 % уменьшалось; после лечения пробиотиком на 32,78 %.
Количество лимфоцитов в крови коров опытных групп увеличивается незначительно в сравнении с кровью больных животных, и приближается к показателям крови здоровых животных.
Моноциты в крови опытных групп по сравнению с показателями больных животных было больше на 18,12 % при применении мастисана А; на 31,54 % при применении пробиотика Зимун-14.40; но в сравнении с кровью здоровых коров уменьшение составило на 41,33 % и 34,67 % соответственно.
Количество сегментоядерных нейтрофилов возрастает по сравнению с содержанием их в крови здоровых коров после лечения пробиотиком на 15,59 %; после лечения мастисаном А на 11,89 %. По сравнению с кровью больных животных сегментоядерные нейтрофилы уменьшаются в опытных группах на 17,72 % и на 20,35 %, соответственно. Палочкоядерные нейтрофилы уменьшаются после лечения пробиотиком на 40,12 %, а после применения мастисана А происходит их увеличение на 2,36 % по сравнению с показателями больных животных соответственно. Нужно отметить, что изменения нейтрофилов находятся в пределах физиологической нормы.
После выздоровления в крови коров опытных групп происходит увеличение количества эозинофилов по сравнению с показателями крови здоровых коров после лечения мастисаном А на 46,88 %, после лечения пробиотиком Зимун-14.40 - на 8,57 %. В сравнении с кровью больных коров количество эозинофилов увеличиваются после применения мастисана А и пробиотика на 37,06 % и на 1,31 % соответственно.
Изменения гематологических показателей, подобно описанным выше, можно наблюдать при усилении функциональной деятельности костного мозга, при повышении функции ретикулоэндотелиальной системы, при активизации окислительно-восстановительных процессов в организме.
У коров, больных субклиническим маститом, воспалительный процесс инфекционного происхождения в вымени вызвал изменения белкового спектра крови: снизилось содержание β-глобулинов при одновременном увеличении основных защитных белков – γ-глобулинов на 12,26 %, по сравнению с аналогичными показателями у здоровых животных.
В крови коров, которым с лечебной целью назначали мастисан А содержание гамма-глобулинов на 4,30 % было ниже по сравнению с аналогичными показателями больных животных. В крови этих животных было отмечено также незначительное увеличение β- и α-глобулинов при одновременном снижении уровня альбуминов.
На фоне применения пробиотика картина белкового спектра крови была иной: на 8,5 г/л по сравнению с больными животными увеличилось содержание общего белка в основном за счет белков, выполняющих защитные функции. Концентрация гамма-глобулинов в крови увеличилась на 14,30 %, β-глобулинов на 22,87 %. Необходимо отметить, что все изменения белкового спектра коров, которым применяли лекарственные препараты были в пределах нормативных показателей для данного возраста.
У больных субклиническим маститом коров в крови наблюдается гипогликемия. Содержание глюкозы в крови больных коров на 17,63 % ниже, чем у здоровых животных. После лечения субклинического мастита мастисаном А уровень глюкозы повышается на 16,78 % по сравнению с показателями больных животных, однако не достигает уровня содержания глюкозы у здоровых коров. Зимун-14.40 оказывает, наряду с высоким терапевтическим эффектом, более выраженное стимулирующее действие. После лечения мастита пробиотиком Зимун-14.40 уровень глюкозы в крови коров был выше на 24,56 % по сравнению с аналогичными показателями в крови больных коров и на 2,06 % уровня глюкозы по сравнению со здоровыми животными.
Уровень пировиноградной кислоты в крови больных животных достаточно высок – ее концентрация на 82,27 % превышала аналогичный показатель у здоровых животных. Применение мастисана А при лечении субклинического мастита у коров вызывает снижение пировиноградной кислоты на 6,41 % по сравнению с показателями больных коров. При этом уровень пировиноградной кислоты остается на 70,58 % выше, а содержание глюкозы на 12,14 % ниже по сравнению с показателем здоровых коров. После лечения коров Зимуном-14.40 в крови содержание глюкозы и пировиноградной кислоты были в пределах физиологических показателей. Содержание глюкозы у этих животных было выше по сравнению с больными животными на 24,56 % и даже превосходило на 2,60 % аналогичные показатели у здоровых коров. Распад глюкозы в организме коров на фоне применения Зимуна-14.40 происходил менее интенсивно, о чём свидетельствует концентрация пировиноградной кислоты – (160,32± 2,06) мкмоль/л (у здоровых животных – (170,31±1,81) мкмоль/л).
У больных коров наряду с гипогликемией наблюдается значительное повышение содержания общих липидов в сыворотке крови. Так, повышение липидов относительно аналогичных показателей в крови здоровых животных составило 40,65 %. Одновременно с увеличением общих липидов в крови наблюдалось снижение холестерина на 51,20 % по сравнению со здоровыми животными. При лечении субклинического мастита мастисаном А уровень холестерина повышался на 49,02 % и понижалось содержание общих липидов на 1,11 % по сравнению аналогичными показателями больных коров.
Пробиотик Зимун-14.40, назначаемый при хроническом воспалительном процессе приводит к изменению содержания основных компонентов липидного обмена в крови, но с ограниченными энергетическими затратами. Так, при его применении содержание холестерина в крови равно (2,05±0,38) ммоль/л, общих липидов (6,40±0,69) г/л. Эти показатели не выходят за границы нормативных данных для животных данной возрастной группы и мало чем отличаются от показателей крови коров, у которых не был обнаружен мастит.
В крови больных животных наблюдали увеличение активности щелочной фосфатазы на 126,34 % по сравнению с аналогичными показателями здоровых животных. В группе коров, где с лечебной целью использовали мастисан А, было также отмечено увеличение концентрации щелочной фосфатазы в сыворотке крови. Однако, эти изменения были на 26,36 % менее выражены по сравнению с больными животными, но по сравнению со здоровыми активность фермента в крови была выше на 66,67 %. В группе, где применяли пробиотик Зимун-14.40 активность щелочной фосфатазы увеличивалась менее интенсивно, чем в группе, в которой использовали антибиотик, и ее изменения были в пределах физиологически нормативных показателей.
В крови коров, больных субклиническим маститом наблюдается повышение лизоцимной активности в 1,3 раза, фагоцитарной активности – в 1,1 раз и бактерицидной активности в 1,2 раза, по сравнению с соответствующими показателями здоровых коров. После терапии мастисаном А наблюдается незначительное повышение исследуемых показателей: лизоцимная активность повышается в 1,6 раз, фагоцитарная – в 1,2 раза и бактерицидная – в 1,4 раза соответственно по сравнению с больными коровами.
Лечение субклинического мастита пробиотиком Зимун-14.40 достоверно увеличивает лизоцимную, фагоцитарную и бактерицидную активность сыворотки крови в 1,7; 1,2 и 1,6 раз соответственно в сравнении с показателями больных животных, а в сравнении с показателями крови здоровых коров в 2,3; 1,4 и 2,0 раз соответственно.
2.7 Изучение физико-химических и санитарно-гигиенических показателей молока при применении Зимун-14.40 при субклиническом мастите у коров
Конечным итогом лечения коров, больных субклиническим маститом, является восстановление продуктивности животных и качественных характеристик получаемого молока. В связи с этим было решено исследовать физико-химические и санитарно-гигиенические показатели молока коров после лечения пробиотиком Зимун-14.40 в сравнении с антибиотиком.
Молоко от первой группы коров – после лечения мастисаном А имело отрицательный результат в пробе с димастином, что свидетельствует о выздоровлении животных. Однако молоко имело отличия по физико-химическим и санитарным показателям от молока здоровых животных.
До лечения молоко коров по бактериальной обсемененности соответствовало III классу ( выше 4 млн. бактерий в 1 см3 . При использовании мастисана А внутривымянно, антибиотик весь срок лечения и после выздоровления выделяется с молоком, о чем свидетельствуют положительные результаты исследования на ингибирующие вещества, бактериальная обсемененность составляет 300-500 тыс. бактерий в 1 см3.
После применения пробиотика кислотность молока повышается до 16,60 ºТ по сравнению с данными до лечения. Повышение кислотности молока коров, которым применяли пробиотик, до нормативных показателей свидетельствует о нормализации титра молочнокислых бактерий, накапливающих молочную кислоту. В то же время молочнокислые бактерии являются антагонистами других видов микроорганизмов (психрофильной, гнилостной микрофлоры и т.д.), содержащихся в молоке. Их развитие подавляется молочной кислотой и как следствие снижается бакобсемененность. Молоко после применения Зимуна-14.40 по бакобсемененности можно отнести к высшему классу (менее 300 тыс. бактериальных клеток в 1 см3).
Плотность и кислотность молока от коров 2-ой группы соответствует требованиям государственного стандарта, массовая доля жира и белка – базисной норме, поэтому молоко от коров, которым с лечебной целью применяли Зимун-14.40 сразу после выздоровления животных может быть реализовано без ограничений 1 сортом.
2.8. Изменения аминокислотного состава молока коров при лечении субклинического мастита у коров
В молоке коров после лечения мастисаном А возрастает содержание практически всех аминокислот, однако, их уровень значительно ниже по сравнению с молоком здоровых животных. Так, содержание аланина, валина, тирозина ниже, по сравнению с аналогичными показателями здоровых животных в среднем на (4-5) %, метионина, аспарагиновой кислоты, лизина, лейцина на (20-22) %, серина, гистидина, изолейцина на (45-48) %. При использовании пробиотика Зимун-14.40 восстановление аминокислотного спектра молока происходит значительнее быстрее. В молоке коров после лечения пробиотиком содержание триптофана было примерно в 2 раза выше по сравнению с данными молока здоровых животных, содержание глицина и цистина в 4 раза, а содержание тирозина, лизина, фенилаланина, аланина, валина на (50-70) % больше.
Биологическая ценность пищевого продукта отражает его способность удовлетворять потребность организма в незаменимых аминокислотах.
В настоящее время биологическую ценность молока принято выражать не в абсолютных, а в относительных величинах, т.е. определять аминокислотный скор, который показывает долю каждой аминокислоты в изучаемом продукте, в сравнении с ее содержанием в «идеальном» белке. Оптимальным считается максимальное количество всех сочетающихся незаменимых аминокислот, обеспечивающих полное удовлетворение в них потребности человеческого организма.
Молоко здоровых коров по содержанию незаменимых аминокислот значительно отличалось от «идеального» белка. Так, аминокислотный СКОР молока здоровых животных в среднем составлял 42,76 % от «идеального» белка, что доказывало низкую питательную ценность данного продукта. При субклиническом мастите данный показатель был еще менее выражен и составлял в среднем 23,33 %. При лечении мастита мастисаном А содержание некоторых аминокислот приближалось к содержанию аналогичных в молоке от здоровых животных, но все же это молоко не имело максимального количества всех сочетающихся аминокислот. Наиболее приближенным к эталону было молоко, после лечения пробиотиком Зимун-14.40. Оно по составу всех незаменимых аминокислот в среднем на 71,94 % соответствовало «идеальному» белку, что свидетельствует о высокой биологической ценности и почти полном удовлетворении потребности человеческого организма в незаменимых аминокислотах при употреблении такого молока.
Экономическая эффективность лечебных мероприятий на 1 рубль затрат при лечении субклинической формы мастита составила:
- в 1 группе, при лечении мастисаном А – 35,45 руб;
- во 2 группе, при лечении пробиотиком – 75,83 руб.
Выводы
1. Пробиотик Зимун-14.40 - препарат, не обладающий острой и хронической токсичностью, эмбриотоксическим, тератогенным, аллергезирующим и местно-раздражающим действием с выраженной бактерицидной активностью к возбудителям субклинического мастита (патогенному стафилококку (St. еpidermidis), кишечной палочке (E. сoli) и бактериям группы кишечной палочки (БГКП)).
2. Наиболее оптимальным способом введения пробиотика Зимун-14.40 с целью лечения субклинического мастита является паравагинальный по 10 мл на животное один раз в сутки. Терапевтический эффект при этом составляет 100 %, продолжительность лечения (4,2 ± 0,13) суток.
3. В крови коров после терапии субклинического мастита пробиотиком установлены следующие изменения:
- возрастает содержание гемоглобина на 7,33 %; увеличивается количество эритроцитов на 81,75 %; число лейкоцитов уменьшается на 32,78 % по сравнению с показателями больных коров;
- достоверно повышается общий белок на 8,5 г/л, за счет увеличения β-глобулинов (на 22,87 %) и γ-глобулинов (на 14,29 %);
- повышается уровень глюкозы на 24,56 %, уровень холестерина - на 1,03 ммоль/л; снижается концентрация пировиноградной кислоты в 2 раза, общие липиды - на 29,12 %, активность АсАТ и АлАТ - на 24,44 % и 57,78 % по сравнению с показателями больных животных.
- повышается лизоцимная активность сыворотки в 2,3 раза; фагоцитарная – в 1,4 раза; бактерицидная активность в 2 раза по сравнению с показателями здоровых коров.
4. Паравагинальное введение пробиотика при субклиническом мастите у коров способствует быстрой нормализации кислотности, плотности молока, увеличению белка и жира до нормативных показателей, снижает бактериальную обсемененность до показателей менее 300 тыс. КОЕ в 1 см3.
5. Использование пробиотика Зимун-14.40 с лечебной целью при субклиническом мастите у коров повышает концентрацию в молоке незаменимых аминокислот (валин, метионин, фенилаланин, лизин, изолейцин, лейцин, триптофан) на (7-6,7) %, и заменимых (серин, аланин, гистидин, цистин, тирозин) в 1,5- 4 раза, при этом молоко на 71,94 % соответствует «идеальному» белку.
6. Использование пробиотика Зимун-14.40 с лечебной целью при субклиническом мастите у коров экономически оправдано - экономическая эффективность проведенных лечебных мероприятий на 1 рубль затрат составляет 75,83 рубля.
Предложения
На основании результатов проведенных исследований рекомендуем для лечения субклинического мастита у коров, вводить пробиотик Зимун-14.40 в паравагинальную клетчатку по 10 мл на голову один раз в сутки до выздоровления.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. Ноздрин, Г.А. Определение чувствительности возбудителей субклинического мастита у коров к препарату Зимун-14.40 in vitro / Г.А. Ноздрин, А.С. Мижевикина, О.В. Епанчинцева // Новые пробиотические и иммунотропные препараты в ветеринарии: Материалы Российской научно-практической конф. / НГАУ, 2003. с. 56-58.
2. Мижевикина, А.С. Изучение острой и хронической токсичности препарата Зимун-14.40 // Новые пробиотические и иммунотропные препараты в ветеринарии: Материалы Российской научно-практической конф. / НГАУ, 2003. с. 73-74.
3. Мижевикина, А.С. Изучение эмбриотропных и тератогенных свойств пробиотика Зимун-14.40 // Молодые ученые в решении проблем АПК: Материалы конф. мол. учен./ Тюмень, 2003. с. 45.
4. Мижевикина, А.С. Физико-химические и санитарно-гигиенические показатели молока при лечении субклинического мастита у коров пробиотиком Зимун-14.40 / А. С. Мижевикина, Г.А. Ноздрин // Актуальные вопросы ветеринарной медицины: Материалы Сиб. междун. ветер. конгр. / Новосибирск, 2005. с. 254-255.
5. Мижевикина, А.С. Влияние пробиотика Зимун-14.40 на морфологические показатели сыворотки крови коров при скрытом мастите // Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. молод. ученых и специалистов / Ижевск, 2005.
6. Мижевикина, А.С. Изменение аминокислотного состава молока при лечении субклинического мастита у коров / А.С. Мижевикина, И.А. Лыкасова, Г.А. Ноздрин // Молочная промышленность.
7. Мижевикина, А.С. Экспериментальные данные по установлению оптимального способа введения и дозы пробиотика Зимун-14.40 при лечении субклинического мастита у коров / А.С. Мижевикина, Г.А. Ноздрин /.
На правах рукописи
Мижевикина Анна Сергеевна
ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОБИОТИКА ЗИМУН-14.40 ПРИ СУБКЛИНИЧЕСКОМ МАСТИТЕ У КОРОВ
16.00.04 – ветеринарная фармакология с токсикологией
автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
Сдано в набор . Подписано в печать .
Формат 60х84/16. Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз.
Заказ № . Гарнитура Times New Roman
___________________________________________________
Издательский центр УГАВМ, лицензия ЛР №021252 от 31 октября 1997 г.
457100, г. Троицк, Челябинская обл., ул. Гагарина 13
